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PCR을위한 뇌관을 디자인하는 방법




위스콘신 대학 (University of Wisconsin)의 BioWeb 웹 사이트에 따르면, PCR을위한 프라이머는 짧고 합성 된 올리고 뉴클레오타이드 (일반적으로 18-25 염기 쌍)이며, 분자 생물학 기술에서 DNA의 특정 영역을 증폭 시키는데 사용된다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR). DNA 가닥에 상보적인 방식으로 설계되고 원하는 DNA 영역에 결합하도록 설계된 제 1 전진 및 제 1 역전이 요구된다 (반대 방향으로 진행하기 때문에 그렇게 명명 됨). 과학자들이 특정 유전자 또는 DNA 영역에 대한 연구를 원할 때 먼저 작업 할 대상 영역을 충분히 확보하기 위해 PCR을 수행해야합니다. 관심 영역에 대한 프라이머 서열을 설계하는 것은 아직 상업적으로 이용 가능하지 않거나 이전에 발표 된 연구로 인해 필요할 수 있습니다.

관심있는 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 DNA 영역을 가져 와서 증폭하고자하는 조각의 길이를 결정하십시오. 정방향 및 역방향 프라이머는 원하는 단편의 처음과 끝에 붙는 방식으로 설계됩니다. 통상적으로, 종래의 PCR 방법은 실시간 염기 서열 법이 50 내지 200 개의 염기쌍을 갖는 단편을 사용하는 반면, 통상적 인 PCR 방법은 100 내지 1000 개의 염기쌍을 갖는 영역에 인접한 프라이머를 사용한다.

서열 중 어느 부분에 프라이머를 결합 시킬지 결정하십시오. 예를 들어 위치가 서열의 5 '또는 3'끝에 가까워 지도록하거나, 아니면 중간에 있기를 원할 수 있습니다. 원하는 경우, 인트론을 스패닝 할 프라이머의 위치를 ​​설계하십시오.

프라이머 설계에 대한 권장 지침을 따르십시오. DNA 제품의 성공적인 증폭은 프라이머의 품질에 달려 있으며 특정 변수가 중요합니다.

18-24 염기쌍 길이의 디자인 용 프라이머. Brinkmann Instruments Inc.의 Vincent R. Prezioso 박사는이 길이가 원하는 DNA 영역에 극히 특이 적이지만 길이가 짧기 때문에 쉽게 결합 할 수 있다고 제안합니다. 프라이머의 용융 온도 (Tm)는 용융이 완료되지만 어닐링이 일어나기에 충분할 정도로 충분히 낮고 55 ~ 80 ℃ 사이 여야합니다. GC 함량 (서열 중 G와 C의 백분율)은 40-60 %이어야합니다. 프라이머 서열의 3 '말단은 G 나 C가 더 강한 결합을하기 때문에 결합을 촉진하기 위해 C 나 G (이것은 GC 클램프라고 부름)에서 종결되어야하지만, 3 개 이상의 G 또는 서열의 마지막 5 염기의 Cs.

당 기술 분야에서 오류를 일으킬 수 있으므로 4 개 이상의 뉴클레오타이드 반복 서열 (ACCCC ...와 같은) 또는 4 개 이상의 디 - 뉴클레오티드 반복 (예 : ATATATAT ...)을 피하십시오. 프라이머 내 상 동성이없는 (동일한 프라이머 내에서 서로 보완하는 3 개 이상의 염기) 또는 인터 프라이머 상 동성 (이는 순방향 및 역방향 프라이머가 상보적인 서열을 가질 때 발생 함)을 갖는 디자인 프라이머. 이것은 프라이머 사이에 자동 이합체 또는 이량 체를 생성 할 수 있는데, 프라이머는 원하는 DNA 서열에 결합하는 대신 스스로 결합한다.

프라이머를 디자인하는 데 도움이되는 온라인 리소스와 웹 사이트를 사용하거나 자체 완성도 또는 헤어핀과 같은 2 차 구조 생성 잠재력에 대한 프라이머 서열을 확인하는 데 도움을줍니다. 일부 프라이머 디자인 웹 사이트에는 Massachusetts Institute of Technology의 Primer3, National Biotechnology Information Center의 Primer-Blast 및 Integrated DNA Technologies의 Oligo Analyzer가 포함됩니다.

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